[摘要] 目的 探讨不同浓度多聚左旋赖氨酸（PLL）对体外培养大脑皮层星形胶质细胞（AS）的影响。 方法 采用酶消法、差速贴壁获得大脑皮层AS细胞，细胞分为四组，分别种植于对照组（未包被PLL）、25 μg/mL PLL包被组、50 μg/mL PLL包被组、100 μg/mL PLL包被组包被的培养瓶或板内，运用细胞计数检测细胞贴壁率及CCK检测法绘制原代细胞生长曲线；待细胞铺满瓶底，予振荡及传代法去除其他类型细胞。第三代AS，通过胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光计数细胞纯度及CCK检测细胞活性。 结果 细胞贴壁率随PLL包被浓度的增加而增加；原代AS生长曲线显示对照组生长速度较三组PLL包被组慢；除100 μg/mL PLL包被组[（90±0.53）%]外，其余各组细胞纯化率均大于95%；对照组第4、6天细胞活性均明显低于各PLL包被组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 PLL能有效地促进AS的贴壁和生长，适宜包被浓度为25～50 μg/mL。
[关键词] 星型胶质细胞；体外培养；多聚左旋赖氨酸；免疫荧光；胶质纤维酸性蛋白
随着近年对大脑皮层星形胶质细胞（AS）的研究发现，AS以积极主动的方式参与调控突触传递，在突触重塑及学习记忆过程中起着重要的作用[1-2]。电生理技术的发展，也让人们了解到，AS存在着许多离子通道[3]，与神经元之间进行着积极的双向信息交流[4]。因此，对AS的深入研究在神经退行性疾病如阿尔茨海默病中得到了进一步的重视[5-6]。多聚左旋赖氨酸（PLL）是常用的包被基质之一，可促进细胞黏附、增生、分化[7]。对体外培养AS中是否使用PLL等促细胞黏附的包被基质，以及PLL工作浓度，各文献报道差异较大，本研究比较了文献中PLL几种常用包被浓度[8-10]，并通过检测细胞贴壁率、纯度、活性以进一步探讨其对体外培养AS的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
新生1～3日龄斯普拉格-杜勒鼠（SD）大鼠（动物合格证号：SCXK渝：2012-0001），雌雄不限，由重庆医科大学动物实验中心提供。
1.2 仪器及试剂
CO2恒温敷箱（Thermo fisher science，美国），倒置显微镜（Olympus，日本），多功能酶标仪（Tecan，奥地利），恒温摇床振荡仪（上海天呈科技有限公司），激光扫描共聚焦显微镜（Leica，德国），荧光显微镜（Olympus，日本）；DMEM高糖培养液（Gibco，美国），胎牛血清（Gibco，美国），多聚赖氨酸（Sigma，美国），Primocin（Invitrogen，美国），胶质纤维酸性蛋白（GFAP）兔抗大鼠多克隆抗体（Sigma，美国），FITC山羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），CCK-8检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 实验分组 实验设为对照组（无PLL包被）、25 μg/mL PLL包被组、50 μg/mL PLL包被组、100 μg /mL PLL包被组。原代前1 d将不同浓度PLL包被于25 cm2培养瓶或不同规格孔板中，次日吸出PLL放于无菌超净台备用。
1.3.2 星型胶质细胞的分离培养 参照文献[11]的方法并适当改进。新生1～3日龄SD大鼠，消毒后断头取脑，剪碎脑组织，加入0.25%胰蛋白酶，37℃下消化18 min，加入含10%胎牛血清的培养基终止胰酶反应，轻轻反复吹打成细胞悬液，400目筛过滤，收集该单细胞悬液，800 r/min离心5 min，按2.5×105个/mL密度接种至未涂PLL的75 cm2的培养瓶中，移入CO2敷箱，37℃、5% CO2下培养20 min[12]，轻轻翻转培养瓶。吸出细胞悬液按密度1.5×105 个/mL分别接种到不同浓度PLL包被的25 cm2培养瓶中。自第3天起，予15%胎牛血清培养基（含primocin 100 μg/mL），每3 d换液1次，培养至9～12 d，细胞铺满瓶底，置于37℃恒温摇床中，200 r/min振荡18 h[13]。另按上述细胞接种密度接种于不同浓度PLL包被的24孔板及96孔板中。
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